ВВЕДЕНИЕ
Коронавирусная болезнь 2019 г. (COVID-19) характеризуется неоднородным течением, варьируя от бессимптомного заболевания у одних до летального исхода у других. По всему миру предпринимаются попытки понять проявления этой инфекции и то, можно ли их использовать в прогностическом и в терапевтическом плане.
Тромбоцитопения и изменение в параметрах агрегации тромбоцитов у больных с COVID-19, особенно среди пациентов с тяжелыми формами заболевания, впервые были отмечены в Китае. В настоящее время существуют данные о том, что количество тромбоцитов и скорость их агрегации – прогностически значимые показатели для оценки тяжести течения и возможной смертности при COVID-19. Доказано, что пациенты с COVID- 19 подвержены повышенному риску как артериального, так и венозного тромбоза.
Тромбоциты играют ключевую роль в системе гемостаза [1, 2]. Во время инфекции активированные тромбоциты прикрепляются к эндотелию сосудов, их гиперактивность приводит к образованию тромба; это, в свою очередь, влечет за собой ишемию тканей и даже легочную тромбоэмболию. Многие вирусы, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гепатита С, вирус гриппа, вирус Эбола и вирус денге, могут напрямую вызывать гиперактивность тромбоцитов [3, 4]. Вирус гриппа напрямую активирует тромбоциты и запускает неконтролируемые каскады коагуляции и последующее повреждение легких [5].
Хотя COVID-19 является респираторным заболеванием, РНК SARS-CoV-2 (возбудителя COVID- 19) может быть обнаружена в крови и использована в качестве индикатора тяжести заболевания [6, 7]. В настоящее время высказываются предположения о способности вируса SARS- CoV-2 напрямую активировать тромбоциты и, следовательно, способствовать их протромботической функции [8]. Ранее проведенные исследования демонстрировали гиперактивность тромбоцитов у пациентов с COVID-19.
Существуют доказательства, что Spike-белок SARS-CoV-2 напрямую связывает ACE2-рецепторы тромбоцитов и усиливает активацию тромбоцитов in vitro. Spike-белок также стимулирует тромбообразование in vivo. Более того, в литературе приводятся сведения о прямой стимуляции тромбоцитов вирусом SARS-CoV-2, что приводит к высвобождению фактора свертывания крови, секреции воспалительных цитокинов и образованию лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов [8]. Показана независимая связь между таким простым и легкодоступным биомаркером, как уровень тромбоцитов, тяжестью заболевания и риском смертности госпитализированных пациентов с COVID-19 [9]. Кроме того, низкий уровень тромбоцитов коррелирует с более высоким показателем в рамках различных шкал для определения тяжести заболевания, таких как MODS (Multiple Organ Dysfunction Score), SAPS II (Simplified Acute Physiology Score) и APACHE II (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation).
Тромбоцитопения у пациентов COVID-19, вероятнее всего, обусловлена многими факторами. В отношении SARS-CoV-2 было высказано следующее предположение: влияние вирусной инфекции приводит к повреждению эндотелия в сосудах легких, вызывая активацию тромбоцитов, их агрегацию и тромбоз, что влечет за собой высокое потребление тромбоцитов и тромбоцитопению [10]. Установлено, что высвобождение тромбоцитов полностью зрелыми мегакариоцитами происходит и в легких. Следовательно, сокращение или морфологическое изменение в легочном капиллярном русле может привести к нарушению этого процесса [10]. Кроме того, коронавирусы способны инфицировать клетки костного мозга, провоцируя аномалии гемопоэза или вызывая аутоиммунную реакцию на клетки крови [7]. Также высказывается предположение, что при SARS-CoV-2 присутствует фоновый синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром) легкой степени, обусловливающий снижение уровня тромбоцитов [10]. Агрегация тромбоцитов – неотъемлемая часть процесса тромбообразования; определение ее скорости позволяет получить представление о степени активности тромбоцитов и соответственно предрасположенности организма к тромбозам и тромбоэмболиям.
Антикоагулянтная терапия у больных COVID- 19-ассоциированной пневмонией способствует снижению частоты венозной тромбоэмболии и уменьшению смертности, хотя и не все эксперты согласны с этим [11, 12]. В г. Ухань (Китай), где началась пандемия COVID-19, 449 пациентов с тяжелой формой COVID-19 были ретроспективно проанализированы на предмет потенциального терапевтического эффекта антикоагулянтов, в особенности гепарина [13]. Хотя исследование было проведено в самом начале пандемии COVID- 19, в его рамках не изучались другие значимые переменные, были получены первые свидетельства того, что применение профилактической дозы гепарина уменьшает смертность. Аналогичный положительный результат применения антикоагулянтов был отмечен в меньшем ретроспективном анализе в Нью-Йорке, где оценивался эффект как нефракционированного, так и низкомолекулярного гепаринов [14, 15].
Цель представленной работы – оценка количества тромбоцитов и индуцированной скорости агрегации тромбоцитов у больных с COVID-19-ассоциированной пневмонией различной тяжести течения заболевания в условиях применения разных вариантов антикоагулянтной терапии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
С апреля по июль 2021 г. в ГАУЗ «Областная клиническая больница № 3» г. Челябинска проводилось неинтервенционное контролируемое открытое одноцентровое обсервационное исследование, в ходе которого было обследовано 75 больных (44 женщины и 31 мужчина) без выявленных ранее онкологических заболеваний, хронических заболеваний сердечно-сосудистой, дыхательной, нервной, эндокринной систем и органов желудочно-кишечного тракта, не принимавших какие-либо антикоагулянты, антиагреганты и нестероидные противовоспалительные препараты перед госпитализацией.
Возраст группы исследования составил 44–75 лет (медиана – 63 года {Q4 55, Q1 68}). У всех пациентов методом мультиспиральной компьютерной томографии (МСКТ) грудной клетки была выявлена двусторонняя вирусная пневмония. Диагноз COVID-19 подтверждался обнаружением на слизистых оболочках зева и носовой полости РНК вируса SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции. Группа контроля была представлена 12 здоровыми добровольцами 41–69 лет (7 женщин, 5 мужчин).
В качестве критерия для разделения пациентов по тяжести течения заболевания использовалась степень поражения легких на МСКТ грудной клетки на момент поступления. Группа 1 была представлена 48 больными с поражением легких менее 50% (КТ 1–2, средняя степень тяжести), группа 2 – 27 пациентами с поражением более 50% легких (КТ 3–41, тяжелая степень тяжести; рис.). Среди наблюдаемой когорты было зарегистрировано 3 летальных исхода в группе больных со степенью поражения легочной ткани более 50% по данным МСКТ органов грудной клетки. Остальные пациенты были выписаны из стационара с улучшением (сатурация крови SpO2 на атмосферном воздухе более 95%, отсутствие лихорадки, снижение уровня С-реактивного белка менее 10 мг/л, уровень лейкоцитов крови более 3,0×109/л).
Подсчет количества тромбоцитов в крови осуществлялся по методу Фонио (микроскопия окрашенного мазка венозной крови), результат выражали в количестве тромбоцитов в 1 л крови.
Исследование скорости агрегации тромбоцитов выполнялось на лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов АЛАТ-2 «БИОЛА», использовались индукторы агрегации с аденозиндифосфатом (2,5 ммоль/мл), коллагеном (3,3 мкг/мл), адреналином (5 мкг/мл) производства ООО «Технология Стандарт» (Россия) на 1-е и 8-е сутки от госпитализации. Приведенные ниже результаты определения скорости агрегации тромбоцитов определялись по кривым среднего размера агрегатов и фиксировались в виде количества относительных единиц в минуту. При исследовании агрегации методом по среднему радиусу за единичный радиус принимался средний радиус тромбоцитов до начала агрегации.
Исследование гемостаза проводилось в 1-е сутки госпитализации (до начала приема антикоагулянтов) и на 8-е сутки после госпитализации и начала терапии антикоагулянтами. Стандартная тромбопрофилактика начиналась в 1-е сутки госпитализации (после забора крови на исследование) и была представлена нефракционированным гепарином натрия (НФГ, производство ОАО «СИНТЕЗ») в дозе 5000 МЕ 3 раза/сут (если вес пациента составлял <120 кг) и 7500 МЕ 3 раза/сут (>120 кг) или низкомолекулярным гепарином (НМГ) эноксапарином натрия (производство ЗАО «БИОКАД») в дозе 40 мг 1 раз/сут (<120 кг) и 40 мг 2 раза/ сут (>120 кг). Препараты вводились подкожно в переднюю брюшную стенку. В зависимости от применяемого антикоагулянта группы 1 и 2 были дополнительно разделены на подгруппы: 1А и 2А получали НФГ, 1Б и 2Б – НМГ. Помимо антикоагулянтной терапии, у всех больных применялась стандартная терапия фавибирином и глюкокортикоидами в соответствии с Временными методическими рекомендациями по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (COVID-19) Минздрава России от 07.05.2021.
Для оценки данных в качестве статистического инструмента была выбрана программа IBM SPSS Statistics (версия 23, производитель – IBM), графики построены в программе Microsoft Excel 2007 (производитель – Microsoft). Для оценки распределения непрерывных переменных использовался тест Шапиро–Уилка. Медиана, верхний и нижний квартили определялись эксклюзивным методом для всех переменных. Критерий Краскела–Уоллиса применялся для проверки равенства медиан нескольких выборок. К тесту Манна–Уитни прибегали для сравнения двух непрерывных переменных без нормального распределения. Принимая во внимание, что переменные не корректировались для множественных сравнений, и учитывая возможность ошибки типа I, результаты следует интерпретировать как исследовательские и описательные.
Статистически значимыми считались значения p ≤0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследование количества тромбоцитов выявило статистически значимые закономерности: при поступлении в стационар у пациентов с тяжелым течением COVID-19 отмечалось снижение этого показателя по сравнению с группой контроля (чьи показатели были приняты за 100%) и пациентами со средней тяжестью заболевания – на 28 и 17% соответственно (табл. 1). Полученные данные демонстрируют зависимость числа тромбоцитов от тяжести заболевания: для больных со значительным вовлечением легких в воспалительный процесс характерно наличие тромбоцитопении.
Количество тромбоцитов менялось при исследовании на 8-е сутки. В подгруппе 1А наблюдалось статистически значимое снижение этого показателя (на 26% по сравнению с группой контроля), тогда как у пациентов, получавших НМГ, определялось некоторое увеличение количества тромбоцитов относительно исходных уровней (табл. 2).
В группе больных с тяжелым течением COVID- 19 (поражение легких на КТ более 50%) отмечалась схожая тенденция: сопоставимое снижение количества тромбоцитов у пациентов, получавших НФГ (на 26% по сравнению с группой контроля). При этом в группе НМГ наблюдался рост числа тромбоцитов – на 20% по сравнению с контролем (табл. 3). Таким образом, влияние антикоагулянтной терапии было заметно как в группе со средней степенью тяжести, так и тяжелым течением болезни: в обоих случаях использование НМГ демонстрировало отсутствие тромбоцитопении, тогда как в группе НФГ имело место снижение числа тромбоцитов.
При сравнении групп, обследуемых с группой контроля, выявлен тренд ускорения агрегации тромбоцитов у всех госпитализированных больных с COVID- 19, не получавших антикоагулянты (см. табл. 1), что коррелирует с результатами проводившихся ранее исследований [7]. В сравнении с контролем скорость агрегации у больных, индуцированная АДФ, значительно не менялась, но в группе 1 (пациенты с менее 50% поражения легких) выявлено ускорение агрегации на 25 и 14% при индукции коллагеном и адреналином. Еще значительнее было ускорение агрегации в группе 2 (пациенты с ≥50% поражения легких): возрастание на 62% при индукции коллагеном и на 37% – адреналином. Также заметно влияние тяжести течения заболевания на скорость агрегации: в группе 2 по сравнению с группой 1 скорость агрегации с АДФ 2,5 была выше в среднем на 11%, с коллагеном – на 23%, с адреналином – на 17% (табл. 1). Исходя из полученных результатов можно говорить о статистически значимом ускорении индуцированной агрегации тромбоцитов, связанной с тяжестью течения заболевания.
Иначе выглядели показатели скорости агрегации тромбоцитов на 8-е сутки от начала приема антикоагулянтов: здесь очевидно влияние на них прогрессирующего воспалительного процесса и лечения. Так, в подгруппе больных 1А, получавших НФГ, агрегация тромбоцитов с индукторами ускорилась на 92% (АДФ), 280% (коллаген) и 238% (адреналин) по сравнению с контролем. В подгруппе 1Б (эноксапарин натрия) аналогичные величины составили 10, 66 и 39% соответственно, т.е. сохранялась тенденция к ускорению агрегации относительно группы контроля. Статистически значимые результаты получены и при сравнении подгрупп 1А и 1Б: скорость агрегации тромбоцитов во всех случаях была выше в группе НФГ (см. табл. 2).
При сравнении скорости агрегации внутри группы пациентов с тяжелым течением COVID- 19 сохранялась привычная тенденция: агрегация тромбоцитов происходила быстрее у больных, получавших НФГ. В подгруппе 2А ускорение агрегации тромбоцитов составило 64% (АДФ), 151% (коллаген) и 66% (адреналин), тогда как в подгруппе 2Б индукция АДФ и адреналином не показала значительных различий в скорости с группой контроля, при индукции коллагеном скорость агрегации тромбоцитов возросла на 27% (см. табл. 3).
Полученные наблюдения свидетельствуют об ускорении агрегации тромбоцитов у больных с COVID-19-ассоциированной пневмонией, а также о влиянии вида гепарина на этот показатель: в группах, получавших НМГ, скорость агрегации меньше, чем в группе НФГ.
ОБСУЖДЕНИЕ
Определение скорости агрегации тромбоцитов с индукторами не является рутинным методом клинической диагностики в стационарах России, однако данное исследование позволяет судить о состоянии системы клеточного гемостаза у пациента, а также терапевтических эффектах проводимого лечения. Значительное количество ранее проведенных клинических исследований доказало, что тромбоцитопения – характерный для COVID- 19 признак патологии клеточного звена гемостаза [16]. В целом уменьшение числа тромбоцитов ниже индивидуального для каждого исследования порога ассоциируется с 5,1-кратным увеличением вероятности тяжелого течения заболевания [16]. Потребление тромбоцитов может быть объяснено такими причинами, как диссеминированное внутрисосудистое свертывание, тромботическая микроангиопатия и гепарин-индуцированная тромбоцитопения [17–19]. При этом тромбоцитопения не всегда носит явный характер вследствие реактивного увеличения продукции тромбоцитов в рамках острого ответа на инфекционный процесс.
Проведенное исследование демонстрирует активную роль клеточного гемостаза, в частности тромбоцитов и их агрегации, в патогенезе COVID- 19. В других недавних исследованиях сообщалось, что различные процессы активации тромбоцитов, включая их агрегацию, способствуют повреждению легких и микрососудистому тромбозу при пневмонии, связанной с SARS-CoV-2 [20]. Долгое время считалось, что вирусы косвенно активируют тромбоциты во время инфекции, создавая воспалительную микросреду и последующую дисфункцию эндотелия сосудов. Однако недавние исследования показали, что между некоторыми вирусами и тромбоцитами существует прямое взаимодействие, и что эти взаимодействия служат важным дополнением к вышеупомянутой активации [21]. Предыдущие исследования показали, что уровень фибриногена у пациентов с COVID-19 повышен, что может активировать тромбоциты, ускорить их агрегацию и усугубить тромбоцитопению [22]. Также предполагается возможность того, что вирус SARS-CoV-2 может напрямую активировать тромбоциты через взаимодействие белка Spike и АПФ-2-рецепторов тромбоцитов, что также может способствовать тромбоцитопении. Причиной ускорения агрегации тромбоцитов может быть их описанная ранее активация продуктами деградации поврежденных вирусом SARS- CoV-2 клеток (в особенности эндотелиоцитов); это, в свою очередь, может выступать одним из факторов, способствующим тромбообразованию и тромбоцитопении [8].
В представленном клиническом исследовании применение эноксапарина натрия в профилактических дозах у больных COVID-19 продемонстрировало значительно более выраженное влияние на скорость индуцированной агрегации тромбоцитов и их количество, чем использование НФГ. Вероятнее всего, наблюдаемые эффекты эноксапарина на агрегацию связаны с его доказанной, более выраженной антиагрегантной активностью по сравнению с НФГ [11].
Несмотря на доказательства активации коагуляции и нарушения фибринолиза, приводящего к отложению фибрина в альвеолярном компартменте у пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом без COVID-19 [23], данные об эффективности и безопасности терапевтических антикоагулянтов у таких пациентов очень ограничены [20]. Некоторые недавние исследования показали, что НМГ способен уменьшать острое повреждение легких в экспериментальных моделях [24, 25]. Метаанализ, включающий девять рандомизированных клинических испытаний с участием 465 пациентов, установил, что использование НМГ снизило 28-дневную смертность, а также увеличило респираторный индекс у пациентов с тяжелым течением COVID-19 [22].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Это открытое контролируемое рандомизированное клиническое исследование продемонстрировало влияние тяжести течения COVID-19-ассоциированной пневмонии как на количество тромбоцитов, так и на скорость их агрегации. Заметно наличие тромбоцитопении у больных со значительным (более 50%) вовлечением легочной ткани в воспалительный процесс. Кроме того, выявлено более выраженное влияние НМГ (в данном случае эноксапарина натрия) по сравнению с НФГ на показатели клеточного гемостаза у пациентов с COVID-19-ассоциированной пневмонией. Исходя из вышесказанного можно предложить дополнение разделов профилактики тромботических осложнений в существующих клинических рекомендациях по ведению больных с тяжелой степенью COVID-19-ассоциированной пневмонии, в частности рекомендовать активное назначение НМГ больным с тяжелым течением заболевания.
Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения крупных клинических исследований для оценки эффективности антикоагулянтной терапии у пациентов с тяжелым и среднетяжелым течением COVID-19.
